骨骼检材DNA提取方法大PK

2021-12-29 11:07:30 来源：复鉴，点击量：4985

从骨架化的人类遗体（尤其是从老化或混合的骨骼）中提取DNA，一直是人类学身份鉴定具有挑战性的方面。2019年刊登在Journal of Forensic Sciences杂志上的Extractionof DNA from Skeletonized Postcranial Remains: A Discussion of Protocols andTesting Modalities回顾了1990年至2018年间由武装部队医学检查员-武装部队DNA鉴定实验室进行的DNA分析实验。对超过13,000种骨骼样本通过四种不同的提取方法进行DNA提取，然后进行以下检测：线粒体DNA测序，STR检测（AmpFlSTRYfiler^TM，AmpFlSTR MiniFiler^TM，PowerPlex Fusion）及NGS，最后分别对四种提取方法、检测方法的成功率进行分析。

研究选取了1999年-2018年间的国防部战俘/军事情报局（DPAA）和军队法医系统的DNA鉴定实验室内收集的样本，样本主要来源于军事冲突战争遗骸（朝鲜战争、东南亚战争、一战、二战等）及非冲突时间（训练事故等），均为无组织残留的骨骼样本。研究人员共使用了四种不同的DNA提取方案：

方法一、不完全脱盐，加上有机提纯；

方法二、通过有机纯化完全脱盐；

方法三、使用QIA quick PCR纯化试剂盒通过无机纯化完全脱盐；

方法四、专为下一代测序设计的提取方法。

由此可见，提取方法对样本的起始量要求在逐渐降低，从2.5g的起始量降低到了0.5g，文中提及目前最低起始量可达到0.05g。但四种方法的孵育温度及条件依旧维持不变，操作细节上的区别主要有以下三点点：1.与之前方法一的顺序不同，方法二和方法三均采用先浓缩后纯化的方案；2. 纯化的方法不同；3. 浓缩采用的耗材不同。

从方法上来说：

方法二更适用于线粒体DNA的检测实验，其成功率达到91%；方法三更适用于STR检测实验；研究人员分析方法一之所以成功率低可能有两方面原因：一是因为其提取试剂中EDTA的含量较低；二是因为其所需的样本起始量较高。而方法三在线粒体DNA方面表现不如方法二的原因可能是由于其浓缩过程使用的column更容易结合大片段DNA，降低了小片段DNA的结合效果。

从骨骼种类上来说：

股骨、腓骨、胫骨来源的样本提取效果通常较好，各种方案均可以获得较高的成功率；而掌骨、脚部骨骼等样本的提取检测效果相对较差，线粒体DNA的提取可以使用方法二和方法三，但STR的检测中各类提取方案的检测效果均很差。

图1 人体骨骼结构图

从STR检测试剂盒上来说：

Power plex fusion试剂盒的检测成功率显著高于Mini filer和Y-filer，Mini-filer和Y-filer的设计初衷就是为了检测降解样本，但本研究发现在使用方法二进行提取的样本检测时，这两个试剂盒的检测成功率（52%和56%）显著低于fusion（92%）。研究人员分析一结果的原因可能是由于实验室内的操作误差导致。同时研究人员也发现Fusion、mini-filer的检测结果具有一致性，很少出现mini-filer检测不出来而fusion可以检测出的结果。

因此无论测试的骨骼来源如何，方法二是线粒体DNA测序的最佳提取方案；对于STR测试，方法三则可以提供更佳的结果。但方法的选择取决于样本的状态、环境以及检测的目的，必须根据实际情况进行综合考虑。因此方法的选择并非单一的“Yes”或者“No”，而是综合因素考虑下的选择。文中介绍的这四类方法也是最为基础的方案，随着科技的发展和样本复杂度的提升，骨骼DNA的提取方法也在不断地优化，以期望能进一步提高样本的检测成功率。

原文链接：

https://doi: 10.1111/1556-4029.14050

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