经过焚烧的骨骼样本，DNA应该怎么提

由于DNA的热变性，严重焚烧的人类遗体样本通常DNA产量低、片段小，因而难以得到理想的STR分型，这对法医学研究提出了特殊的挑战。而另一方面，古生物学家长期致力于从降解的考古标本中提取DNA，其形成的方法在短片段提取中已得到有效证明。为了验证古DNA提取方法是否可以应用于法医实践，美国亚利桑那州立大学人类进化和生物考古学的研究团队与马里科帕县法医办公室合作，对火灾案件中多种骨骼样本分别使用Dabney等人发表过的古DNA提取方法和Loreille等人发表过的法医骨DNA提取方法进行提取，比较DNA产量和STR图谱的完整性。

作者对23个来自车辆，房屋火灾和火葬场的个体进行采样，样本包括颅骨（顶骨和颞骨碎片）、趾骨、跖骨、掌骨、胫骨和前臼齿，并根据燃烧温度导致的骨变色程度进行分类：I：保存良好/中等；II：黄色或棕色（200-300℃）；III：黑色或熏制（300-550℃）；IV：灰色（550-650℃）；V：煅烧成灰（>650℃）。使用金刚石切割轮切割骨头碎片，然后用锤子粉碎。

                                                                                                       表1. 不同燃烧程度的样本

Loreille的法医骨DNA提取方法：

每份骨粉在15ml离心管中用3mL 0.5M EDTA，52μl N-月桂酰肌氨酸钠（0.5％）和100μl蛋白酶K（20mg/mL）组成的缓冲液完全脱盐并裂解，室温孵育24小时；

3000 x g离心1分钟，取上清；

用装有Ultracel-PL 30-kDa膜的Amicon Ultra 4离心装置将上清液浓缩至≤100μl；

用MinElute™PCR Purification Kit柱纯化浓缩的上清液；

用25μl EB洗脱两轮，保存在-20℃。

Dabney的古DNA提取方法：

每份骨粉在1mL 0.5M EDTA中进行软化处理，室温震荡孵育24小时，将上清液转移至到2mL MAXYMum Recovery PCR管中；

在骨粉沉淀的管中加入1ml由1％聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）、2.5mM N-吩噻唑溴化铵（PTB）、5mM氯化钙（CaCl2）、50mM二硫苏糖醇（DTT）、20mM Tris-HCl（pH 8.0）、0.5％N-月桂酰肌氨酸钠和20mg/mL蛋白酶K组成的裂解缓冲液进行消化，25℃金属浴孵育24小时；

最大速度离心30秒，将上清液转移至之前装有1mL脱盐上清的管中，每个样品中总共有2 mL脱盐和裂解的上清液；

对沉淀重复上述流程，使每个样品的脱盐和裂解的上清液总量达到4mL。

每次用1mL上清液与13mL由5M盐酸胍（GuHCl）、90mM乙酸钠（pH5.2）、Tween-20和40％异丙醇组成的结合缓冲液充分混合，用Zymo-SpinV柱纯化；

得到的上清液用MinElute™PCR Purification Kit柱再次纯化；

用25μl EB洗脱两轮，保存在-20℃。

提取的DNA用Quantifiler™ Trio DNA RT-PCR Quantification Kit定量试剂盒，对常染色体上一种多拷贝的大片段（LA：214bp）和小片段（SA：80bp）区域进行检测，以确定DNA的浓度和降解情况，并根据LA：SA的比值计算DNA平均降解指数DIM。7500 Real-time PCR system对DNA总量进行定量。

最后用PowerPlex® ESX 17试剂盒扩增，比较不同提取方法对STR结果的影响，并用GlobalFiler™复核确认结果准确。

                                                                                                                                表2-1. 定量结果

                                                                          图1.不同燃烧等级样品的平均DNA浓度（ng/μl）

结果显示，从平均DNA产量上来看，两种方法总体差别不大，产量与温度升高之间不出所料呈负相关。Loreille的全骨脱盐提取法似乎对II类燃烧样品效果更显著，而在IV类燃烧样品中释放的更多的小片段。

图2. 不同样本类型（依次为跖骨、顶骨，胫骨、指骨、掌骨、前臼齿、桡骨和颞骨）平均DNA浓度（ng/μl）

如图2所示，两种方法都成功从跖骨、顶骨、胫骨、指骨和掌骨中提取了一定量的DNA，不同方法在不同类型的样本上表现差异较大。对于两个前臼齿，使用Dabney方法提取了平均0.07ng/μl的DNA，而Loreille方法没能提取成功。从两个胫骨样本（平均DNA产量= 0.002ng/ul）和颞骨碎片（Dabney提取平均产量0.0002 ng/ul；Loreille提取平均产量0.00002 ng/ul）中只检测到极微量的DNA。此次实验中长骨、颅骨和手骨是最佳的DNA来源，这可能是皮质骨致密的结构完整性所造成的。

                                                                                                                                                                         表2-2. STR结果

                              3. 不同方法提取不同燃烧等级样本所得到的STR图谱数量

从提取结果中选择两种方法各40个，共80个进行STR分型，共得到48个完整的STR图谱，其中46个来自I-III类样本，说明对燃烧温度>350℃的样本STR显著降解。Dabney的古DNA法在更高燃烧等级的样本中获得了几个样本的部分STR图谱。根据不同片段大小STR图谱峰值判断DNA的降解情况。

对燃烧等级IV、V的样本由于降解严重，片段较短的mini-STR和midi-STR更有可能检出峰值。此时，Dabney的古DNA法取得了更好的效果。例如对于V类燃烧，Dabney提取的ASU_0022_cat5样本所有三个mini-STR、加上一个midi-STR（D12s391）以及至少两个其他较长的基因座均显示等位基因，而同一样本用Loreille提取仅在一个mini-STR有峰。

图4. 两个V级燃烧（>650℃）样本的部分STR结果。上面是Dabney的古DNA方法，下面是Loreille的法医DNA方法

总体来看，受限于法医面临不同样本的复杂情况，很难总结出一种适用于所有情况的最佳方法。但是在某些案例中（例如燃烧严重的特定骨骼样本），使用古DNA提取方法可以提高获得更高质量的DNA和更完整的STR图谱的成功率。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.fsigen.2020.102272